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ORIGINAL ARTICLE

Early preconditioning of the ischemic spinal cord: experimental study in rabbits

Albert Amin Sader0; Leila Maria Cardão CHIMELLI0; Soraya Lopes SADER0; José BARBIERI NETO0; Joaquim COUTINHO NETO0; José Eduardo de Salles Roselino0; Sebastião Assis MAZZETTO0

DOI: 10.1590/S0102-76381998000200008

ABSTRACT

Early preconditioning of the spinal cord was investigated in rabbits, as an eventual protection mechanism, immediately before a 30 min ischemic period. Eight-seven New Zealand rabbits divided into 6 groups were assigned to the study. Ischemia of the spinal cord was induced by crossclamping (C) the abdominal aorta distal to the emergence of the left renal artery. Preconditioning was stimulated by short and sometimes repetitive ischemic periods, underlined in the text, and followed by different periods of reperfusion. Group I - Control: In 20 animals the aorta was crossclamped for 30 min. In two of them (10%) motricity and sensitivity of the hind-legs and tail were entirely restored; the other 18(90%) became paraplegic. Group II - Sham operation: 10 animals were operated as the ones in the previous group except for the fact that the aorta was not clamped. All of them (100%) had their sensitive and motor functions entirely restored. Group III - Preconditioning: 10 animals - (C) 1 min ® 15 min® (C) 30 min ® final reperfusion. All animals became paraplegic. Group IV - Preconditioning: 6 animals - (C) 1 min ® 5 min® (C) 2 min ® 5 min ® (C) 2 min ® 5 min ® (C) 30 min final reperfusion. Five rabgbits (83,33%) became paraplegic and 1 (16,66%) became monoplegic. Group V - Chlorpromazine: 20 animals were given chlorpromazine, intravenously, 2 mg/kg, 10 min before aortic crossclamping. Eleven animals (55%) had their sensitive and motor functions reestablished and 9 (45%) became paraplegic. Group VI - Clorpromazine + preconditioning: 21 animals were given chlorpromazine as those of group V and were preconditioned as follows: (C) 1 min ® 5 min ® (C) 1 min ® 5 min ® (C) 30 min ® final reperfusion. Nine animals (32.8%) recovered the sensitive and motor functions and 2(9.52%) experienced partial recovery. The remaining ones (47.68%) became paraplegic. Statistical analysis of the results demonstrated that: 1) there was no significant difference between groups III and IV, and when both of them were compared to group I (p < 0.05); 2) there was no significant difference between groups V and VI, but the difference was significant when both of them were compared to group I (p<0.05). Hystologic study - Twelve animals were assigned exclusively to histologic study: 6 control animals and 6 that were preconditioned as follows: (C) 1 min ® 5 min ® (C) 1 min ® 5 min ® (C) 30 min ® 5 h reperfusion. The percentage of ischemic neuronal cells showed a great dispersion of values, with no significant difference between groups, considering the median of those values (p < 0.005).

RESUMO

Investigou-se a possibilidade de desencadear o fenômeno do pré-condicionamento, imediatamente antes da esquemia de 30 minutos, como meio adicional de proteção medular nos casos de pinçamento aórtico prolongado. Oitenta e sete coelhos da raça Nova Zelândia, distribuídos em 6 grupos, foram estudados. A isquemia medular resultou do pinçamento (P) da aorta abdominal, imediatamente após a origem da artéria renal esquerda. Estimulou-se o pré-condicionamento por curtos e repetidos períodos de isquemia, assinalados no texto por grifo, seguidos por variáveis tempos de reperfusão. Grupo I - Controle: 20 animais tiveram a aorta pinçada por 30 min. Dois (10%) recuperaram integralmente a motricidade e a sensibilidade das patas posteriores e cauda; 18 (90%) tornaram-se paraplégicos. Grupo II - Operação simulada: 10 (100%) animais operados como os do grupo anterior, exceto pelo não pinçamento da aorta, recuperaram plenamente as funções sensitivo-motoras. Grupo III - Pré-condicionamento: 10 animais - (P) 1 min ® 15 min ® (P) 30 min ® reperfusão final. Todos (100%) tornaram-se paraplégicos. Grupo IV - Pré-condicionamento: 6 animais - (P) 1 min ® 5 min ® (P) 2 min ® 5 min ® (P) 2 min ® 5 min (P) 30 min ® reperfusão final. Cinco (83,33%) coelhos ficaram paraplégicos e 1 (16,66%) ficou monoplégico. Grupo V - Clorpromazina: 20 animais receberam clorpromazina por via endovenosa, na dose de 2 mg/kg peso, 10 min antes do pinçamento aórtico. Onze (55%) tiveram recuperação sensitivo-motora integral e 9(45%), ficaram paraplégicos. Grupo VI - Clorpromazina + pré-condicionamento: 21 animais receberam a clorpromazina como os do grupo anterior, sendo pré-condicionados da forma (P) 1 min ® 5 min ® (P) 1 min ® 5 min ® (P) 30 min ® reperfusão final. Nove 42,8%) tiveram recuperação sensitivo-motora integral e 2 (9,52%), recuperação parcial. Os demais (47,68%) ficaram paraplégicos. A análise estatística demonstrou não haver diferença significativa entre os resultados dos grupos III e IV, e quando ambos foram comparados com o grupo I. Não foi significativa a diferença entre os grupos V e VI, mas foi significativa quando ambos foram comparados com o grupo I (p<0,05). Estudo histológico - Outros 12 animais foram usados exclusivamente para o estudo histológico sob microscopia óptica: 6 do grupo controle e 6 com pré-condicionamento do tipo (P) 1 min ® 5 min ® (P) 1 min ® 5 min ® (P) 30 min ® reperfusão de 5 h. Os resultados, avaliados pelo percentual de neurônios isquêmicos, evidenciaram importante dispersão dos valores, sem diferença significativa entre os grupos, considerando-se a mediana desses números (p < 0,05).
INTRODUÇÃO

O cérebro de várias espécies, quando submetido a curtos períodos de isquemia subletal, torna-se mais resistente a um ulterior período isquêmico, geralmente determinante da morte neuronal (1-8). Esse fenômeno, conhecido como pré-condicionamento, é observado também em outros tecidos, particularmente no miocárdio (9-13). Parece ser intrínseco das células, e essa resistência pode se desenvolver mediante outros estímulos (6), dentre os quais se destaca a hipertermia (14-16).

O seu complexo mecanismo molecular não é inteiramente conhecido. Todavia, parecem bem caracterizadas a participação de um grupo de proteínas denominadas, em inglês, "Heat Shock Proteins (HSP)" ou "Stress Proteins", em especial as de peso molecular 70.000 (HSP-70) e 72.000 (HSP-72) (6, 14, 16-19), da adenosina (20-25), da Proteína Kinase C (26) e a ativação de um programa genético que envolve a expressão de fatores específicos de transcrição (27).

É possível que esse mecanismo multifatorial seja diverso para distintos grupos celulares, a julgar pelas pesquisas realizadas em animais de laboratório. Enquanto no miocárdio a resistência adquirida se desenvolve precocemente, em minutos (9, 10, 12, 13), no cérebro ela é geralmente observada após várias horas ou dias. Contudo, SCHURR et al. (1), em 1986, trabalhando com fatias do hipocampo submetidas a curtos períodos de anóxia (5 min), verificaram que a adaptação protetora dependia do tempo decorrido entre o estímulo e a anóxia lesiva. Embora tivesse sido detectada após 30 minutos, ela se acentuou ao cabo de 2 horas.

Em trabalho recente, PÉREZ-PINZÓN et al. (28) demonstraram, em ratos, ser possível provocar o fenômeno, 30 minutos apenas, após o estímulo condicionante, embora a neuroproteção tenha quase desaparecido no 7º dia de reperfusão.

Na medula espinal, o pré-condicionamento não tem sido devidamente pesquisado. Por essa razão, desenvolveu-se o presente estudo, cujo objetivo foi tentar provocá-lo, precocemente, de modo que pudesse ser usado como recurso adicional de proteção medular pelos cirurgiões cardiovasculares.

MATERIAL E MÉTODOS

Coelhos da raça Nova Zelândia, com prevalência de machos, pesando entre 1,5 e 2,2 kg, foram usados no estudo. Como agente anestésico empregou-se o pentotal sódico, por via endovenosa, na dose de 30 mg/kg peso, exceto nos animais dos grupos V e VI que tiveram a dose reduzida em 50%. Os animais permaneceram respirando, espontaneamente, ar atmosférico durante todo o experimento. A isquemia medular resultou do pinçamento (P) da aorta abdominal, imediatamente após a origem da artéria renal esquerda, abordada por laparotomia transumbilical. Estimulou-se o pré-condicionamento por curtos, diferentes e, por vezes, repetidos períodos de isquemia, assinalados no texto por grifo, seguidos por variáveis tempos de reperfusão. Na seqüência, provocou-se a isquemia medular lesiva, pré-estabelecida em 30 min.

Oitenta e sete animais foram distribuídos nos seguintes grupos:

Grupo I - Controle: 20 animais tiveram a aorta justa-renal exposta, dissecada e pinçada por 30 min.

Grupo II - Operação simulada: 10 animais operados como os do grupo anterior, exceto pelo não pinçamento da aorta.

Grupo III - Pré-condicionamento do tipo (P) 1 min ® 15 min (P) 30 min ® reperfusão final: 10 animais.

Grupo IV - Pré-condicionamento do tipo (P) 1 min ® 5 min ® (P) 2 min ® 5 min ® (P) 2 min ® 5 min ® (P) 30 min ® reperfusão final: 6 animais.

Grupo V - Clorpromazina: 20 animais receberam clorpromazina por via endovenosa, na dose de 2 mg/kg peso, 10 min antes do pinçamento aórtico.

Grupo VI - Clorpromazina + pré-condicionamento: 21 animais receberam a clorpromazina como os do grupo V, sendo, depois, pré-condicionados da forma (P) 1 min ® 5 min ® (P) 1min ® 5 min ® (P) 30 min ® reperfusão final.

Mediu-se a temperatura retal dos animais durante o experimento e, para evitar queda superior a 2ºC, banhou-se a cavidade peritoneal com solução de NaCl 0,9%, a 40ºC.

Os animais foram observados por períodos variáveis de 36 a 72h, especialmente no que se refere à recuperação sensitivo-motora das patas posteriores e cauda. Identificaram-se 3 situações: 1) Recuperação integral: os animais eram capazes de andar normalmente ou com discreta rigidez das patas posteriores, e apresentavam viva sensibilidade à compressão da cauda; 2) Paraplegia: os animais não apresentavam qualquer movimento espontâneo ou estimulado, nem sensibilidade na cauda; 3) Recuperação parcial: os animais apresentavam movimento espontâneo e/ou estimulado sem, contudo, poderem se apoiar nas patas posteriores e andar. Monoplegia foi outra forma de recuperação parcial, com sensibilidade presente da cauda.

Estudo Histológico

Doze coelhos foram usados exclusivamente para o estudo histológico sob microscopia óptica: 6 do grupo controle e 6 com pré-condicionamento do tipo (P) 1 min ® 5 min ® (P) 1 min ® 5 min ® (P) 30 min ® reperfusão final de 5 horas. Os animais foram então re-anestesiados e perfundidos por via ventricular esquerda, sucessivamente, com solução de NaCl 0,9%, a 4ºC, e formol 10%, tamponado, na proporção de 1 ml/g de peso corpóreo.

Os corpos foram levados ao refrigerador e, 24 h depois, retiraram-se as medulas espinais, imersas no mesmo fixador por 48 h, no mínimo. Em seguida, mediante cortes transversais, retiraram-se de 7 a 8 fragmentos, com 2 mm de espessura, dos segmentos cervical, torácico e lombar, os quais foram processados para inclusão em parafina e corados com hematoxilina e eosina.

O número de neurônios isquêmicos, expresso em termos porcentuais, foi avaliado por contagem de todas as células neuronais da metade anterior da medula, em pelo menos 4 cortes tomados na intumescência lombar.

As células neuronais isquêmicas caracterizavam-se por picnose ou apagamento nuclear e intensa eosinofilia citoplasmática (Fig. 1 ).


Fig. 1 - Fotomicrografia de um corte da medula lombar de coelho submetido ao pré-condicionamento, seguido de isquemia de 30 minutos e reperfusão de 5 horas. A seta maior aponta uma célula neuronal normal cujo núcleo não aparece neste corte. Nota-se, porém, a substância de Nissl com distribuição normal. A seta menor aponta uma célula neuronal isquêmica na qual se observa grave desarranjo estrutural, caracterizado pelo núcleo picnótico e pela intensa eosinofilia citoplasmática. Os demais elementos celulares pertencem à glia. Hematoxilina e eosina. X 900.

Análise Estatística

Para a análise estatística dos resultados neurológicos usaram-se os testes do Qui-quadrado e o exato de Fisher; para os resultados do estudo histológico, empregou-se o teste de Mann-Whitney Rank Sum.

RESULTADOS

Os resultados da avaliação neurológica encontram-se na Tabela 1. Observa-se que nos grupos I e II, 10% e 100% dos animais, respectivamente, recuperaram integralmente as funções sensitivo-motoras. Entre ambos, a diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05). No grupo III nenhum animal recuperou-se e no grupo IV, apenas 1 (16,66%) teve recuperação parcial. Comparados com os do grupo I (controle) e entre si, os resultados dos animais submetidos aos 2 esquemas de pré-condicionamento não evidenciaram diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).



A clorpromazina (grupo V) protegeu 55% dos animais, resultado estatisticamente significativo quando comparado aos 10% do grupo controle (grupo I). Todavia, a associação do pré-condicionamento não melhorou os resultados da clorpromazina isoladamente. A comparação dos resultados obtidos nos grupos V e VI não evidenciou diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).

Estudo Histológico

Nos segmentos cervical e torácico, os neurônios apresentaram-se inteiramente normais. No segmento lombar, o número de células neuronais isquêmicas mostrou grande dispersão dos valores porcentuais nos 2 grupos, mais acentuada no grupo de pré-condicionamento. A análise estatística baseada nos valores das medianas não evidenciou diferença significativa entre os dois grupos (p < 0,05).

COMENTÁRIOS E CONCLUSÕES

A indução do pré-condicionamento depende da duração da isquemia-estímulo e do tempo decorrido entre esta e a isquemia lesiva (1, 2, 4, 25). Por outro lado, a proteção dele decorrente varia com a duração da isquemia lesiva (6) e com o tempo de reperfusão (28).

No presente estudo foram avaliados, inicialmente, dois esquemas de pré-condicionamento rápido: o primeiro, com apenas um estímulo curto de 1 min, seguido por um igualmente curto período de reperfusão; o segundo, com três estímulos intercalados por períodos de 5 min de reperfusão. Para uma isquemia lesiva de 30 min, não se observou nenhuma proteção que se traduzisse por menor incidência de paraplegia. Diante desses resultados e com base em pesquisa anterior deste grupo (29), usou-se a clorpromazina isoladamente e em associação com outro esquema de pré-condicionamento precoce. A proteção conferida pela clorpromazina confirmou os resultados anteriormente obtidos em ratos. Todavia, a associação com o pré-condicionamento não melhorou esses resultados, mesmo considerando os animais que tiveram recuperação parcial.

É provável que a isquemia-estímulo de 1 min provocada no grupo III, e duas vezes no grupo VI, seja insuficiente para determinar a despolarização anóxica das células neuronais. No cérebro de ratos Wistar, ela ocorre, geralmente, após 2 min de isquemia (28). Por outro lado, os estímulos repetidos realizados no grupo IV, embora não tenham ultrapassado, em conjunto, 5 min, podem ser lesivos para certos grupos de células neuronais (3).

Os resultados desta pesquisa não afastam inteiramente a possibilidade de se promover o pré-condicionamento precoce da medula espinal isquêmica. A avaliação neurológica, baseada no comprometimento sensitivo-motor, pode não ser bastante sensível para detectar o fenômeno. Além disso, uma eventual proteção pode ter sido insuficiente para evitar danos irreversíveis das células neuronais, provocados pela isquemia de 30 min. O que se pode afirmar, no entanto, é que, nas formas aqui apresentadas, o pré-condicionamento não serve aos propósitos dos cirurgiões cardiovasculares. Provavelmente, a indução farmacológica do pré condicionamento, alguns dias antes da isquemia programada, seja o caminho mais promissor (23, 30).

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